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CFSE/7-AAD双染细胞毒性检测试剂盒是利用细胞荧光染料CFSE(CFDA-SE)和7-AAD对细胞进行染色，利用CFSE标记靶细胞，7-AAD标记死的靶细胞来区分不同的细胞，活的靶细胞成绿色，死的靶细胞成红色和绿色，从而检测细胞毒性作用。
根据不同的实验方案设计，可以用来检测化合物的细胞毒性作用。也可以用来检测杀伤性T细胞或NK细胞介导的细胞毒作用。
CFDA-SE是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞。CFDASE是一种带有琥珀酰亚胺(NHS)的荧光染料，可以结合细胞内的蛋白质。CFDASE在结构上将酚羟基部位改造成AM体，所以自身不发荧光，荧光背景低，脂溶性高，能够轻易穿透细胞膜，进入细胞内的CFDASE的AM部位能被细胞内酯酶水解生成CFSE，通过共价结合赖氨酸侧链的氨基而掺入细胞内和细胞表面的蛋白，且结合后发出强的绿色荧光。CFSE的琥珀酰亚胺(NHS)和细胞内蛋白质的氨基部位结合，固定在细胞内，不会漏出细胞外。CFSE进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细胞核的荧光最强。
CFSE毒性小，不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全地得到想要的实验数据。
CFSE/7-AAD标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞毒性检测。
一般试剂盒采用PI与CFSE联用，但是由于PI的发射波长是<625nm，通常在FL2中检测，对CFSE的干扰大。而且由于波谱较宽，同时在FL3中也能测，所以用了PI最多再加一个CFSE，FL3就没法用了。PI还有一个重要的缺点是不容易清洗干净，使用后清洗流式细胞仪更加费时费物。
7-AAD/CFSE试剂盒有效的解决了这些弊端，7-AAD的发射波长是650nm，只占用FL3通道进行检测，FITC、PE两个通道受影响都小，可以做三色分析。
CFSE标记细胞呈绿色荧光，荧光波长：λex=496nm,λem=516nm。流式检测时的激发波长可以选择488nm，此时的发射波长为516nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。7-AAD标记细胞呈红色荧光，流式检测时的激发波长可以选择488nm，此时的发射波长为650nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL3 detection channel。
CFSE标记的细胞除了流式细胞仪检测细胞毒性外，还可单染后用于细胞增殖检测，或者用荧光酶标板定量活细胞数目，或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察。
检测方法：
● 荧光显微镜● 流式细胞仪● 激光共聚焦
样本类型：
● 悬浮细胞● 贴壁细胞
试剂盒以外自备试剂和仪器:
● 流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦● 离心机● CO2培养箱● PBS或者HBSS（不含酚红）

组份	500T	1000T
试剂A：CFSE荧光探针	500μL	500μL×2
试剂B：7-AAD染色液	500μL	500μL×2

CFSE探针-20℃避光保存，7-AAD染色液2～8℃避光保存，有效期6个月。
注：
● 染料长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
● 染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
● 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。


● 旋帽离心管装试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
● 染色浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。
● CFSE母液极易水解，建议分装保存，分装后用封口膜密封管口，再用锡箔纸包裹，最后和干燥剂一起用塑料袋密封，≦-20℃冷冻保存。
● 冬天气温较低时CFSE溶解液会凝固，可先在37℃水浴至溶解液完全融解后再进行配制，配制过程中注意避免溶液凝固，保持温度至CFSE溶解完全。
● CFSE工作液应现配现用，不能提前配制，因为CFSE吸水会分解，影响染色效果。
● CFSE易被水解，在水溶液中会很快变质。母液请在使用过程中避免接触水。工作液在标记细胞的过程中和水接触是在许可的时间范围内的。
● CFSE标记细胞仅需5～15分钟即可完成。对于不同细胞，最佳标记时间需自行摸索。正式实验前，建议先做几个孔摸索染色浓度和加入CFSE试剂后的培养时间。
● 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
● 以下实验步骤仅供参考，请根据实际的实验方案设计或参考相关文献为准。
● 必须设置全阴，CFSE单标，7-AAD单标的靶细胞的参照以设置流式。


细胞CFSE染色：
1.根据需要检测的细胞样品数，用HBSS将CFSE母液200～4000倍稀释，配制成CFSE染色工作液。不同的细胞需要根据预实验结果确定最佳染色浓度。如果荧光强度弱，可以适当提高CFSE的终浓度。如果背景太高，可以适当降低CFSE的终浓度，请摸索条件找到最佳浓度。
注：
● 也可以用HBSS等缓冲液或相应的无血清培养基稀释染料母液至所需浓度。
● 开始实验前，使用HBSS缓冲液或培养基稀释CFSE到需要的工作浓度。工作浓度为根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，一般染色终浓度200～4000倍稀释。
● 一般起始浓度按500～1000倍稀释即可。
● 为了降低过度加载染料导致的潜在背景和细胞毒性，在不影响实验结果的前提下应尽可能低浓度染色。
● 工作液现配现用。
2.将培养好的待测靶细胞消化后收集，用PBS洗涤2次。
注：
● 400g离心5分钟。
3.将待测细胞用染色工作液重悬，至细胞浓度大约107/ml。
4.在37℃培养箱中避光孵育15～30分钟。
5.加10倍体积的含血清培养基，400g离心5分钟。
6.离心后去上清，收集细胞，用HBSS或无血清培养基洗涤细胞1～2次，最后加入培养基重悬细胞。
7.在37℃培养箱中孵育20～30分钟。
细胞模型制备：
1.收集待检测的靶细胞。
2.进行相应的毒性药物处理或者效应细胞处理。
注：
● 效应细胞和靶细胞比例根据需要自行设定。常见比例如6.25：1；12.5：1；25：1等。
● 活的靶细胞成绿色；死的靶细胞成红色和绿色；死的效应细胞成红色，活的效应细胞成无色。
细胞检测：
1.收集制备好的毒性处理过的细胞模型。
2.用200μL HBSS重悬细胞，加入1μL 7-AAD染色液，混匀。
注：
● 微量的染色液注意有效的加入细胞悬液并充分混匀。
● 可以根据预实验确定的染色液浓度，直接用7-AAD和HBSS缓冲液配制成染色工作液，并用染色工作液重悬细胞。
3.在2～8℃避光孵育10～60分钟。
4.在400g离心5分钟收集细胞。
5.用500μL HBSS或PBS重悬细胞。
6.取500μL细胞悬液，用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
7.根据流式结果计算死亡细胞百分率。被杀伤死亡的靶细胞被7-AAD染上会出现在CFSE+7-AAD+区域，未杀伤的在CFSE+7-AAD-区域，得出被杀伤的靶细胞的比例。用这个比例再计算毒性。
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